Ефективність індивідуального добору за азотфіксувальною здатністю із гібридних популяцій ранніх поколінь зернобобових культур

УДК 581.1    Ефективність індивідуального добору за азот фіксувальною здатністю із гібридних популяцій ранніх поколінь зернобобових культур. Методичні рекомендації

Засвоєння азоту із атмосфери сприяє збільшенню урожайності зернобобових культур і поліпшенню її якості. У роботі наведені основні показники симбіозу, методи оцінки азотфіксувальної здатності, основні механізми взаємодії рослини-господаря і мікросимбіонта.  Подані дані про особливості генетичного контролю процесу азотфіксації та формування симбіотичного комплексу у процесі онтогенезу рослин зернобобових культур. Показано, що максимально використати симбіотичний потенціал можливо лише за умови комплементарного добору макро- і мікросимбіонтів. Запропонована схема  покращення азотфіксувальної здатності селекційним шляхом.

Вступ

Зернобобові культури у світовому землеробстві займають друге місце після зернових як за посівними площами, так і валовими зборами. Достатньо сказати, що сою вирощують на площі біля 111 млн. га, квасолю – на 29, нут – більше 13, вигну – 11, горох – понад 6 млн. га. Такі культури як польові боби, каянус, сочевиця, вика, люпин висівають на 1-5 млн. га. У ХХІ сторіччі ними займають все більше орних земель, особливого поширення набувають соя, вігна, квасоля, нут. Так, за період з 2000 по 2012 рік площі посіву сої зросли на 43, 4%, вігни – 41,4%, каянуса – 23,2%, квасолі – 20,4%, нуту – 19,7%.

Така позитивна динаміка цих культур обумовлена тим, що вони є найбільш дешевим джерелом повноцінного білка, суттєвий дефіцит якого існує на нашій планеті, особливо на африканському континенті. Крім того, не менш важливе їх агротехнічне значення. Вони є поліпшувачами ґрунтів, за рахунок симбіотичної азотфіксувальної здатності засвоюють значну кількість азоту із повітря, перетворюють важкорозчинні фосфорні сполуки в доступну для більшості культурних рослин форму. Після їх збирання на кожному гектарі поля в ґрунті залишається значна кількість легкодоступного для інших культур в сівозміні азоту. Бульбочки, які розвиваються на корінні рослин, є центром, навколо якого формується комплекс корисних мікроорганізмів, куди входить, крім бульбочкоутворюючих, також певна кількість асоціативних. Вся ця сукупність мікроорганізмів розміщена в прикореневій зоні, важливу роль виконують також мікоризоутворюючі гриби, які перетворюють недоступні для рослин сполуки фосфору в засвоювану форму. Таким чином, при вирощуванні зернобобових культуру ризосфері рослин створюється важливий комплекс мікроорганізмів, які засвоюють азот із атмосфери, перетворюють нерозчинні сполуки фосфору в доступні, а також збагачують ґрунт органічною речовиною.

У процесі такого співіснування продукти метаболізму одних видів слугують харчовими компонентами для других, в результаті чого у ґрунтах не нагромаджуються токсичні сполуки.

Однією з головних причин погіршення родючості ґрунту в нашій країні є порушення сівозмін за рахунок вирощування енергонасичених культур, які швидко виснажують ґрунт, в ньому накопичуються в значній кількості токсичні речовини та хвороботворні мікроорганізми. Виправити таку ситуацію можливо впровадженням науково обґрунтованого набору культур, що сприяє підвищенню продуктивності сільськогосподарських угідь, поліпшенню родючості ґрунтів, зменшенню чисельності хвороб і шкідників, зниженню забур’яненості полів. Даний захід не потребує додаткових капіталовкладень, його роль особливо зростає у даний період, коли має місце інтенсивне впровадження мінімальних і нульових технологій обробітку ґрунту та короткоротаційних сівозмін.

Зернобобові культури здатні формувати симбіотичні взаємовідносини з великою групою ґрунтових мікроорганізмів, що сприяє покращенню мінерального живлення рослин, поліпшенню водного режиму ґрунту,  росту і розвитку, захисту від патогенів. Найбільш поширеним у рослинному світі є бобово-ризобіальний симбіоз і арбускулярномікоризні взаємовідношення. Обидві ці мутуалістичні системи вирізняються високим рівнем генетичної та метаболічної спорідненості порівняно з іншими мікроорганізмами, які заселяють ризосферу рослин.

Більшість дослідників вважає, що за рахунок азотфіксації зернобобові культури забезпечують 80-90% необхідного для одержання високого врожаю азоту, а в окремих дослідженнях за оптимальних умов соя зв’язувала із повітря до 450кг/га азоту.

За ефективного симбіозу поліпшується мінеральне живлення рослин, стимулюються їх ріст і розвиток, збільшується продуктивність, посилюється стійкість до хвороб і шкідників. При цьому спостерігається високий рівень інтегрування фізіологічних і метаболічних процесів макро- і мікросимбіонтів.

Покращення азотфіксувальної здатності зернобобових культур лише на 15% в грошовому еквіваленті становить один мільярд доларів США.

Зв’язування молекулярного азоту із повітря є досить складним біологічним процесом, у якому синхронно взаємодіють генетичні системи макро- і мікросимбіонтів. Крім того, на рівень біологічної азотфіксації значно впливають такі фактори як наявність вологи в ґрунті, температура, відносна вологість повітря, концентрація мінерального азоту в живильному середовищі, активність фотосинтезу рослини-господаря. Таким чином, симбіотичні бактерії відіграють важливу ролі у функціонуванні системи ґрунт-рослина-мікроорганізми, позитивно вливаючи на біохімічні процеси в ґрунті, які сприяють нагромадженню в ньому органічної речовини, підвищенню урожайності сільськогосподарських культур, збереженню навколишнього середовища від забруднення синтетичними сполуками.

Комплексні дослідження біологічної фіксації азоту із повітря інтенсивно проводяться у багатьох країнах світу, в яких вивчаються фізіолого-біохімічні механізми цього процесу, шляхи перетворення інертної молекули азоту в доступні для рослин азотні сполуки. Важливим аспектом є визначення характеру успадкування головних показників симбіотичної системи «бобові рослини-бульбочкові бактерії». Значну цінність являють результати дослідження початкових етапів контактної взаємодії макро- і мікросимбіонтів, ролі біологічно активних речовин, які виділяють проростаюче насіння з однієї сторони та клітини ризобій з іншої. Біохімічні результати свідчать про важливу роль в процесі симбіозу лектинів коріння рослин і полісахаридних сполук ризобіальних клітин.

У зв’язку з вищенаведеним виняткового значення набуває можливість управління мікробіологічними процесами з метою підвищення урожайності та покращення якості сільськогосподарської продукції. В окремих дослідженнях в США й Таїланді посіви сої зв’язували 311-450 кг/га азоту із повітря за дуже сприятливих умов вирощування.

У представленій роботі зроблена спроба систематизувати одержані результати, нагромаджені в процесі вивчення взаємодії великого набору генотипів сої, нуту та гороху та штамів бульбочкових бактерій. У дослідженнях, які були проведені в польових і лабораторних умовах, крім Селекційно-генетичного інституту – Національного центру насіннєзнавства та сортовивчення, значний вклад внесли вчені нинішнього Інституту сільського господарства Криму (колишні Південна дослідна станція Інституту сільськогосподарської мікробіології та Кримська сільськогосподарська дослідна станція) Патика В.П., Мельничук Т.М., Толкачов М.З., Дідович С.В., Князєв О.В., Пташник О.П. Сподіваємось, що наведені тут дані будуть стимулювати в майбутньому проведення комплексних досліджень селекціонерів і мікробіологів на більш високому науковому рівні із застосуванням сучасних біотехнологічних та генномолекулярних методів. Американські вчені вважають, що генна інженерія, фотосинтез і біологічна фіксація азоту є найбільш важливими темами сьогодення.

1. ОСНОВНІ ПОКАЗНИКИ СИМБІОЗУ

Біологічна фіксація азоту рослинами є основою круговороту цього елемента в природі. Цей процес по відношенню до рослин можливо розділити на дві групи. Перша включає несимбіотичні мікроорганізми, які зв’язують азот із повітря і живуть на корінні рослин, або знаходяться в ґрунті. Всі вони знаходяться в зоні ризосфери й активно засвоюють кореневі виділення, які слугують їм джерелом енергії. З другої сторони, рослини використовують для своєї життєдіяльності метаболіти мікроорганізмів. Таким чином, у ризосфері створюється специфічна взаємовигідна система «рослина-мікроорганізм», яка збагачує ґрунт на такі біологічно активні речовини, як органічні кислоти, амінокислоти, ферменти, ауксини, вітаміни тощо. У таких асоціаціях приймають участь різні роди мікроорганізмів – Agrobacterium, Arthrobacter, Azospirillum, Azotobacter, Clostridium, Enterobacter, Pseudomonas.

Інша група азотфіксаторів – це симбіотичні бактерії, які формують на корінні бобових культур специфічні органи – бульбочки, де і проходить зв’язування атмосферного азоту. Енергія для них надходить у вигляді продуктів фотосинтезу, а синтезовані в бульбочках азотовмісні сполуки рослини використовують для свого росту і розвитку, а також для формування врожаю.

Особливістю цієї групи мікроорганізмів є те, що їх азотфіксувальний потенціал реалізується в результаті взаємодії генів рослини-хазяїна і бактерії. За вдалого добору макро- і мікросимбіонтів у багаторічних бобових трав можливо досягти рівня азотфіксації до 500 кг азоту, а у зернобобових культур до 300кг на кожному гектарі посіву.  Важливо відмітити, що зв’язаний таким чином атмосферний азот є екологічно чистим, оскільки засвоюється рослинами повністю, тоді як внесений у вигляді мінеральних добрив лише на половину. Друга його частина або переходить у більш глибокі горизонти ґрунту, або змивається дощовими водами і забруднює навколишнє середовище. Тому так важливо генетичними методами збільшити азотфіксувальний потенціал зернобобових культур, оскільки їх вирощують на значних площах.

Симбіотична азотфіксація включає такі процеси як специфічність до рослини-господаря, вірулентність і азотфіксувальна здатність. Специфічність полягає в тому, що певні види бульбочкових бактерій здатні вступати в симбіоз лише з одним видом рослин  або з обмеженою їх кількістю. Вірулентність – це здатність проникати в коріння рослини-господаря і формувати бульбочки. Азотфіксувальна здатність залежить від активності специфічних ферментних систем, а також факторів довкілля.

В останні роки мікробіологами відселектована значна кількість високоактивних штамів бульбочкових бактерій для різних зернобобових культур і багаторічних трав, дещо менше уваги звертається на роль генотипу рослини-господаря в процесі реалізації азотфіксувального потенціалу.

2. МЕТОДИ ВИЗНАЧЕННЯ АЗОТФІКСУВАЛЬНОЇ ЗДАТНОСТІ ЗЕРНОБОБОВИХ КУЛЬТУР

Основою симбіотичної активності є фермент нітрогеназа, який забезпечує відновлення атмосферного азоту до NH₄⁺ і функціонує в анаеробних умовах, в бульбочках він захищений від кисню іншими ферментами. Тому для визначення рівня зв’язування азоту з повітря в лабораторних умовах застосовують ацетиленовий метод, заснований на відновленні нітрогеназою ацетилену до етилену. За даної методики нітрогеназний ферментний комплекс моделює природний процес, який проходить у бульбочках при перетворенні молекулярного азоту до аміаку, тобто ці реакції мають подібну хімічну природу і за кількістю відновленого етилену можливо судити про азотфіксувальну здатність. У найпростішому вигляді даний аналіз проводять наступним чином. У пробірку вносять певну кількість свіжих бульбочок, герметично її закупорюють гумовою пробкою, шприцом вводять 10%-й ацетилен. Після інкубації кількість відновленого етилену визначають на газовому хроматографі. Ацетилен-відновлювальну здатність вираховують за спеціальною формулою.

В Інституті фізіології рослин і генетики Національної академії наук України В.М. Крикунець рекомендує визначати ацетиленвідновлювальну активність рослин сої наступним способом. З відмитого водою коріння з бульбочками відбирали частину, яку поміщали в медицинський шприц об’ємом 50 мл. Вводили поршень до помітки 30 мл, а конус для голки закривали ковпачком, виготовленим із вакуумної гуми. У ковпачку був зроблений шилом прокол. За допомогою другого такого ж шприца в камеру зі зразком вводили через ковпачок 20 мл суміші повітря з ацетиленом у співвідношенні 75:25. У такій газовій суміші бульбочки знаходились 30 хв. за кімнатної температури. Після закінчення періоду інкубації шприцом на 2 мл через гумовий ковпачок відбирали пробу газової суміші для аналізу на газовому хроматографі. Кількість етилену визначали на основі хроматограм. З метою точного аналізу нітрогеназної активності певної рослини важливо перед початком експерименту підрахувати загальну кількість бульбочок на ній та їх частину, яка буде поміщена в шприц-камеру. Після закінчення інкубаційного періоду визначали загальну кількість та масу бульбочок на рослині шляхом об’єднання тих, що знаходились у шприці та залишились на частині кореня, які не були використані для інкубації. При кінцевому розрахунку враховували дані хроматографічного аналізу та загальну кількість і масу бульбочок.

Для прискореного одержання результатів запропонований так званий банковий метод аналізу ацетиленвідновлювальної активності (Wacek T.J., Brill W.J., 1976).  Він полягає в тому, що рослини вирощують в невеликих банках на вермикуліті. Після зрізання стебла рослини банка закривається спеціальною гумовою кришкою. Введення ацетилену і відбір газової суміші після інкубації проводиться шприцами через гумову кришку.

В інших дослідженнях був запропонований досить простий недеструктивний метод оцінки великої кількості рослин за рівнем азотфіксації. Інокульовані проростки вирощували за стерильних умов на вермикуліті у пляшечках певного об’єму, які закривали спеціальним пластиковим ковпачком. Рослини поливали вільним від азоту живильним розчином. Ефективність азотфіксації визначали у 2-тижневих проростків ацетиленовим методом. Ацетилен вприскували безпосередньо в пляшечки.

Значне поширення одержав також ізотопний метод оцінки азотфіксувальної здатності. Відомо, що частка N¹⁵ є стабільною в атмосферному повітрі. Тому для визначення кількості зв’язаного азоту в ґрунт вносять мічений N¹⁵, який може засвоюватися рослинами. На такій ділянці висівають експериментальні зернобобові культури, а також рослини, що не здатні фіксувати азот із повітря, які слугують як контроль. Обидві форми рослин засвоюють азот із ґрунту, який містить і N¹⁵. Крім того, у зернобобову культуру поступає певна частка і симбіотичного азоту. Кількість засвоєного із повітря азоту вираховують за спеціальною формулою після визначення загальної кількості цього елементу в рослинах зернобобових культур, а також частки в ньому N¹⁵. Останній аналізують на мас-спектрометрі. Точність визначення азотфіксувального потенціалу цим методом суттєво залежить від правильного добору контролю, який не фіксує азот. Ним можуть бути рослини, які не формують бульбочок, або ізолінії зернобобових культур, у яких генетично заблокований симбіоз. Дуже важливо, щоб як дослідні зернобобові культури, так і контрольні рослини зв’язували однакову кількість мінерального азоту із ґрунту.

Суттєву інформацію про інтенсивність азотфіксації можливо одержати при аналізі соку ксилеми рослин зернобобових культур, які ростуть в польових умовах. Метод заснований на тому, що засвоюваний із повітря азот у рослині перетворюється в алантоїн або алантоїнову кислоту, які відносяться до групи уреїдів. А із мінерального азоту, який поступає із ґрунту, формуються нітрати, аміди та амінокислоти. Тому за рівнем уреїдів у соку ксилеми можливо судити про азотфіксувальну здатність зернобобової культури. Важливо зауважити, що цей метод можна застосовувати при роботі з такими культурами як соя, каянус, вігна, квасоля, псофокарпус. У нуту, сочевиці, гороху, польових бобів, арахісу, білого люпину основна кількість фіксованого азоту в бульбочках перетворюється в аміди (аспарагін і глютамін) і в ксилему переноситься у цій формі. Для цієї групи культур необхідні додаткові експерименти з метою пристосування цієї методики для оцінки азотфіксувальної здатності.

У польових умовах рівень азотфіксації можливо оцінити на основі порівняння кількості засвоєного загального азоту бобовими та не бобовими рослинами, вирощеними поруч. Точність цієї методики повністю залежить від добраного контролю, який не здатний зв’язувати азот. Він повинен мати приблизно такий же об’єм і морфологічні особливості кореневої системи та по можливості подібний характер засвоювання азоту із ґрунту.

Певну інформацію про здатність до азотфіксації можна почерпнути на основі аналізу кількості бульбочок на рослині та їх маси. Не дивлячись на те, що ці показники не завжди точно відображають кількість зв’язаного азоту, їх легко рахувати та оцінювати. Численні дослідження свідчать про більшу інформативність маси бульбочок порівняно з їх чисельністю. Бульбочки варіюють за кількістю та формою у різних зернобобових культур. Важливо, щоб їх вміст характеризувався червоним кольором, що свідчить про ефективну азотфіксацію. У наших дослідженнях та в багатьох інших авторів нітрогеназна активність позитивно пов’язана з кількістю та масою бульбочок на рослині. Так, у 2011-2012 роках на безазотному субстраті (вермикуліт) при випробуванні ряду сортів сої та штамів бульбочкових бактерій найбільш тісний зв’язок існував між кількістю та масою бульбочок (0,80-0,93). Зв’язок між нітрогеназною активністю та кількістю бульбочок мав середнє значення (0,42-0,44).

На сьогоднішньому етапі досліджень не існує єдиного критерію оцінки ефективності симбіозу, тому для більшої об’єктивності краще використовувати ряд показників – нітрогеназну активність, кількість і масу бульбочок, приріст надземної вегетаційної маси, урожай насіння та вміст в ньому білка.

3. ХАРАКТЕР УСПАДКУВАННЯ ПОКАЗНИКІВ СИМБІОЗУ

Численні дослідження показали, що процес біологічної азотфіксації контролюється багатьма генами. Деякі з них діють на  початкових етапах симбіозу, інші експресуються в процесі онтогенезу. На сьогоднішній день відомо, що гени рослини-господаря проявляють свою дію більш активно на початкових фазах цього процесу (специфічність, вірулентність, бульбочкоутворення). Таким чином, від генів рослини залежить формування, розвиток, структура  і функціонування бульбочок.

Описаний ряд генів, які блокують симбіоз при певному поєднанні макро- і мікросимбіонтів. У ряді випадків бульбочки зовсім не формуються, інколи вони мають ненормально малий розмір і є неактивними. Як правило, такі фенотипові прояви симбіозу контролюються одним рецесивним або домінантним геном. З генетичної точки зору це є мутації, які виникли спонтанно. Деякі із цих генів блокують формування бульбочок, інші спричиняють порушення на етапі зв’язування азоту із повітря. В останні десятиріччя відкриті так звані супернодулюючі мутанти сої, особливістю яких є формування великої кількості бульбочок на рослині навіть за наявності значної кількості мінерального азоту в ґрунті. Це так звані nts – мутанти, фенотипова природа яких обумовлена дією рецесивних генів.

Бульбочки, які розвиваються на корінні зернобобових культур, є місцем, де зв’язується азот із атмосфери. Їх розвиток і функціонування контролюються генами рослини-господаря. Але важливо зауважити, що вони не формуються за відсутності інокуляції певним штамом бульбочкових бактерій, тобто в процесі симбіозу повинен існувати постійний зв’язок між обома його учасниками. Гени рослини-господаря, які приймають участь у формуванні бульбочок і в зв’язуванні ними азоту із повітря, називають нодулінами (nod гени). Ті із них, які експресуються на ранніх етапах розвитку бульбочок, контролюють синтез білків, які впливають на кількість, форму та диференціацію в процесі онтогенезу бульбочок. Крім того, вони взаємодіють з генами бактерій, в результаті чого формується інфекційна нитка, яка потім перетворюється у бактероїд. Нодуліни також відіграють важливу роль у біосинтезі леггемоглобіну. Дослідження свідчать про те, що існує ціла сім’я леггемоглобінових генів, яка виникла в процесі еволюції шляхом дуплікації.

Гени бульбочкових бактерій сої Bradyrhizobium japonicum, які безпосередньо приймають участь в азотфіксації, поділяють на дві групи – nif і fix, кожна із яких формує свій кластер. Група генів nif кодує синтез MoFe і Fe білків нітрогенази – основного фермента, від якого залежить рівень азотфіксувального потенціалу.

В останні роки чітко доказана наявність, крім «великих» генів, значної кількості полігенів, які також суттєво впливають на інтенсивність зв’язування азоту із повітря. Такий характер успадкування рівня симбіотичної азотфіксації та показників бульбочкоутворення дає можливість їх покращення шляхом гібридизації спеціально добраних батьківських форм і штучного добору із гібридних популяцій.

Наведені дані свідчать про досить складний і багатоступеневий генетичний контроль процесу азотфіксації зернобобових культур. Проведені нами на протязі більше 30 років польові й лабораторні дослідження свідчать про те, що нітрогеназна активність і показники бульбочкоутворення успадковуються за кількісним типом. Їх можливо аналізувати статистичними методами кількісної генетики, такими як коефіцієнти успадковуваності та мінливості, вичленяти генетичну та екологічну варіанси. У більшості випадків коефіцієнти успадковуваності цих показників суттєво залежать від добраних батьківських компонентів схрещування. Якщо вони досить різняться значеннями бобово-ризобіального симбіозу, то, як правило, у гібридних популяцій ранніх поколінь має місце значна генетична мінливість і тут спостерігають відносно високі коефіцієнти успадковуваності. При схрещуванні близьких за азотфіксувальними ознаками форм генетична варіабельність є невисокою і коефіцієнти успадковування, як правило, є низькими. Існує суттєва генетична мінливість за початком бульбочкоутворення після появи сходів, кількістю бульбочок на рослині та їх масою, лінійними їх розмірами.

4. ФОРМУВАННЯ СИМБІОТИЧНОГО КОМПЛЕКСУ В ПРОЦЕСІ ОНТОГЕНЕЗУ ЗЕРНОБОБОВИХ КУЛЬТУР

Процес симбіозу зернобобових культур з бульбочковими бактеріями є досить складним, він включає ряд послідовних взаємозв’язків, які приводять до формування спеціалізованого органу – бульбочок, які розвиваються на корінні. Ці утворення є мініатюрним «заводом», де проходить зв’язування атмосферного азоту в доступні для рослини сполуки. Бульбочкоутворення на рослині розпочинається з тісної взаємодії кореневих волосків з ризобіями, які знаходяться в ґрунті. Але до цього контакту необхідні певні специфічні умови, оскільки у ризосфері рослини знаходиться безліч різноманітних мікроорганізмів, в тому числі й азотфіксувальних. Дослідження останніх років свідчать про те, що проростаюче насіння зернобобових культур, а також коренева система, яка формується на початкових етапах росту, виділяють спеціальні органічні речовини (метаболіти), які включають вуглеводи, білки, амінокислоти, низькомолекулярні органічні кислоти. Ці речовини слугують джерелом енергії для різного виду мікроорганізмів. Важливо зауважити, що суттєву роль у постачанні енергетичних матеріалів відіграє листковий апарат проростків, поскільки у ньому за рахунок фотосинтезу утворюються вуглеводи, які потім поступають у кореневу систему, включаються в обмін речовин і частина цих продуктів попадає на поверхню коріння. Серед цих компонентів існують такі, які сприяють рухові бульбочкових бактерій на поверхню коріння, що дає можливість бактеріям колонізувати певні частини кореневої системи. Дослідження свідчать, що такими «сигнальними» сполуками кореневих виділень можуть бути нуклеїнові кислоти, вуглеводи, флавоноїди, органічні кислоти, ферменти, вітаміни, амінокислоти, алкалоїди, фітогормони. В останні роки дослідники особливу роль в розпізнаванні мікробного партнера симбіозу відводять лектинам рослини-господаря. Їх поява на поверхні проростаючого насіння та коренів слугує сигналом для контакту клітин ризобіїв.  Крім того, використання певних розчинів лектинів дозволяє стимулювати азотфіксувальну здатність бульбочок в процесі онтогенезу.

З іншого боку, ризобіальні клітини, які знаходяться в ґрунті поряд з кореневою системою, також здатні до руху в певному напрямку, який визначається градієнтом екстрактивних речовин рослинного походження. Таким чином, специфічний рух бульбочкових бактерій у природному середовищі обумовлений специфікою речовин, які виділяються проростаючим насінням і кореневою системою. Цим твердженням можливо пояснити і відмінності між штамами, які більш активно колонізують певні сорти зернобобових культур.

Рядом досліджень останніх років чітко доказана суттєва роль як сигнальних молекул для бульбочкових бактерій таких біологічно активних сполук насіння зернобобових культур як лектини і флавоноїди. Установлено, що лектини здатні зв’язуватись з екзополісахаридами і ліпополісахаридами ризобіїв,  що сприяє фіксації бактеріальних клітин на певних ділянках коренів, що в подальшому може привести до їх проникнення в тканини і формуванню бульбочок. Як показують дослідження, лектини здатні також посилювати симбіотичні властивості бульбочкових бактерій за рахунок кращої вірулентності та конкурентоздатності. Приблизно такою ж дією характеризуються ізофлавони, які знаходяться в насінні та кореневих ексудатах (виділеннях) зернобобових культур. Особливо багато флавоноїдних сполук містить насіння сої, яка слугує сировиною для одержання медичних препаратів, якими лікують серцево-судинні захворювання людей.

Таким чином, як лектини, так і флавоноїдні сполуки є важливими індукторами бульбочкоутворення, за рахунок яких відбувається постійний взаємозв’язок між рослиною-господарем і ризобіальними клітинами, що після ряду суттєвих перетворень призводить до формування бульбочок.

Узагальнюючи результати експериментальних досліджень, можливо зробити висновок, що одним із найбільш важливих первинних етапів взаємодії симбіонтів є цілеспрямований рух бактеріальних клітин до поверхні коріння зернобобових культур, вектором якого є певні органічні речовини.

Як ми вже відмічали, утворення бульбочок у зернобобових культур є досить складним і тривалим процесом, який включає колонізацію бактерією поверхні кореневого волоска певного періоду розвитку, активізацію nod – генів,  проникнення в тканину кореня, розмноження ризобій та формування інфекційної нитки, яка перетворюється у бактероїд, де якраз і проходить відновлення молекулярного азоту. Всі ці перетворення відбуваються за рахунок енергії вуглеводів, які синтезуються у процесі фотосинтезу. Після того, як бактерія закріпилась на поверхні кореневого волоска, проходить розм’якшення стінок клітин кори під дією слизу, яким покритий ризобій, та ферменту протопептинази, синтез якого був індукований цим контактом. При цьому кореневий волосок певним чином скручується, формується шляхом інтенсивного ділення клітин інфекційна нитка, через яку проникають бактерії в клітину рослини. Інфекційна нитка розростається, галузиться, формується меристематична зона в результаті ділення клітин кори кореня. Із інфекційної нитки постійно утворюються бактероїди шляхом формування навколо них перибактероїдної мембрани. На даному етапі вони вже здатні зв’язувати азот із повітря за рахунок діяльності фермента нітрогенази. Перибактероїдна мембрана бактероїда відіграє важливу роль, поскільки через неї відбувається інтенсивний обмін речовин між макро- і мікросимбіонтами, тобто вона служить як транспортна система. Оточений мембраною бактероїд ще називають симбіосомою.

Бульбочки суттєво різняться формою. Так, у арахісу вони гіллясті, округлі та крупні, у люцерни та гороху – гіллясті грушовидні, люпину, квасолі та сої – грушовидні.

5. СЕЛЕКЦІЯ ВИСОКОПРОДУКТИВНИХ ШТАМІВ БУЛЬБОЧКОВИХ БАКТЕРІЙ

Для повної реалізації азотфіксувального потенціалу зернобобових культур необхідний ретельний добір штаму бульбочкових бактерій та сорту рослини-господаря. Для цього необхідний постійний пошук нових штамів, які виділяються покращеними симбіотичними ознаками. Для їх створення, як правило, використовують традиційні методи – гібридизація та експериментальний мутагенез. В останні роки також розпочали інтенсивно застосовувати методи молекулярної генетики та генетичної інженерії. Перенесення генетичного матеріалу від одного організму до іншого у бактерій можливий шляхом генетичної трансформації та трансдукції. Ці методи придатні також для бульбочкових бактерій. Експериментальна робота таким способом полягає у створенні рекомбінантної плазміди, яка включає у свою структуру і гени азотфіксації (nif-гени). За такої схеми існує можливість ціленаправленого їх переносу від донора до реципієнта і досягнення їх експресії. Важливо пам’ятати, що оцінити азотфіксувальний потенціал nif – генів можливо лише за наявності симбіозу з бобовою культурою. Тому остаточний висновок про вірулентність, конкурентоспроможність та азотфіксувальну здатність новостворених таким чином штамів роблять у польових умовах бо вегетаційних дослідженнях.

Значна кількість високоефективних штамів бульбочкових бактерій одержана шляхом хімічного або фізичного мутагенезу. Особливо в останні роки з цією метою досить інтенсивно використовують транспозоновий мутагенез, заснований на використанні здатності мігруючих генетичних елементів довжиною 200-5700 пар нуклеотидів вбудовуватись у новий генетичний матеріал і експресуватись у ньому. З цією метою формують специфічні одиниці – транспозони, які здатні мігрувати від однієї клітини до іншої. Цей метод у 2-3 рази ефективніший порівняно з експериментальним мутагенезом. У нашій країні його досить раціонально використовують для одержання високоцінних штамів для люцерни та сої в Інституті фізіології рослин і генетики НАН України.

Оскільки має місце інтенсивне нарощування посіві сої в Україні, у сівозміні культура досить часто висівається на одному і тому ж полі через 4-5 років, а то й частіше. Це призводить до нагромадження в ґрунті спонтанних ризобіїв, які можуть конкурувати з внесеними з насінням штамами. Тому останні повинні поєднувати як високу азотфіксувальну здатність, так і бути добрими конкурентами.

6. СПЕЦИФІЧНІСТЬ БОБОВО-РИЗОБІАЛЬНОГО СИМБІОЗУ В ЗАЛЕЖНОСТІ ВІД СОРТУ РОСЛИН І ШТАМУ БУЛЬБОЧКОВИХ БАКТЕРІЙ

Максимально використати симбіотичний потенціал зернобобових культур можливо лише за умови комплементарного добору макро- і мікросимбіонтів, взаємодія яких між собою призводить до високого рівня зв’язування азоту із повітря. На жаль, на сьогоднішній день не існує методик,  які б дозволили досить швидко виявити такі високосимбіотичні пари. На практиці їх знаходять шляхом випробування значного набору сортів і штамів бульбочкових бактерій або в польових умовах, або на безазотному живильному середовищі. Незважаючи на те, що існує велика мінливість між варіантами сорт-штам, у ряді випадків удається знайти такі штами, які є досить активними на більшості випробуваних сортів. З іншого боку, також можливо виявити сорти, які є досить  чутливими до більшості штамів. Але найбільш ефективним шляхом є ведення селекційної роботи з певною зернобобовою культурою з метою створення комплементарних пар сорт-штам, які поєднують високі насіннєву продуктивність, азотфіксувальну здатність та показники бульбочкоутворення. Добір за цими показниками ведеться починаючи з ранніх гібридних поколінь, що дає можливість багаторазової комплексної оцінки за різних умов, що складаються протягом вегетаційного періоду.

Оцінка великого набору генотипів сої із різних країн світу дозволила виявити ряд сортозразків, які формували велику кількість бульбочок і зв’язували багато азоту із повітря за наявності високого рівня азоту в ґрунті. Такі генотипи назвали «толерантними до мінерального азоту». Найбільше таких форм виявили серед колекційного матеріалу із Кореї та Австралії. На жаль, за рівнем урожайності вони поступалися районованим у цих країнах сортам.

Селекційні програми, направлені на поєднання високої азотфіксувальної здатності та підвищеної урожайності проводяться з соєю в США, Австралії, з квасолею – в Колумбії, США, Австралії, Бразилії та деяких країнах Африки. Міжнародне агентство з атомної енергії (ІАЕА) в 1985-1991 роках провело об’ємні дослідження з метою виявлення азотфіксувального потенціалу квасолі в Австрії, Бразилії, Чилі, Колумбії, Гватемалі, Мексиці та Перу. Виявили окремі генотипи, які зв’язували більше 100 кг/га азоту, хоча ця культура відноситься до дуже інертних у відношенні до симбіозу рослин.

У своїх вегетаційних дослідженнях на вермикуліті ми використали добре відомий у виробництві сорт сої Аркадія одеська, недавно занесені до державного реєстру сорти Ятрань і Сяйво, площа посіву яких постійно розширюється, а також сорти Симфонія і Фенікс, які проходять державне випробування. Показники їх симбіозу за 2011 і 2012 роки наведені в таблиці 6.1. Необхідно відмітити, що у контрольному варіанті 2012 року мало місце незначне формування бульбочок на проростках, що обумовлено попаданням бактерій або з насінням, або через живильне середовище.

За кількістю бульбочок на рослині виявили дуже сильну сортову залежність від штаму. Наприклад, на рослинах сорту Ятрань за інокуляції експериментальним штамом Х-9 в середньому за два роки сформувалось 31,2 бульбочок, тоді як у сорту Аркадія одеська всього 6,5, а у сорту Сяйво – 10,4. Перевагу цього штаму за кількістю бульбочок на рослині спостерігали і у сорту Фенікс. У цілому штам Х-9 виявився найбільш продуктивним за середнім значенням кількості бульбочок у всіх сортів (табл. 6.2), найбільша їх кількість сформувалась на проростках сорту Ятрань (табл. 6.3). У середньому за інокуляції всіма штамами на рослинах сорту Ятрань нарахували 19,1 бульбочок, тоді як у сорту Аркадія одеська їх кількість становила 9,4, а у сорту Симфонія – 10,6 штук.

Важливо зауважити, що штам Х-9 досить чітко виділився позитивною дією у сортів Аркадія одеська, Ятрань і Симфонія за масою бульбочок на рослині на протязі двох років. У сорту Сяйво він був кращим за цим показником у 2012 році. Таким чином, цей штам в середньому за всіма сортами виявився найкращим за масою бульбочок на рослині (табл. 6.2). Серед сортів за цим показником також перевагу має Ятрань (табл. 6.3).

Нітрогеназна активність у всіх сортів була невисокою. Штам М-8 був найбільш ефективним за цим показником у сортів Аркадія одеська та Фенікс. Високе його значення нітрогеназної активності спостерігали також у сортів Ятрань, Симфонія, Сяйво. Надземна маса проростків у всіх варіантах була вищою порівняно з контролем і суттєво залежала від штаму бульбочкових бактерій (табл. 6.1). У сортів Аркадія одеська, Ятрань і Симфонія найбільш ефективними за цим показником штамами виявились М-8 і Х-9, у сорту Сяйво – 36 і ГС-4, у сорту Фенікс – ГС-4 і М-8. В цілому за всіма штамами надземна маса проростків була досить близькою (табл. 6.2). Сорт Сяйво виділився серед інших за цією ознакою (табл. 6.3).

Важливо також відмітити добре співпадання таких досліджуваних ознак як маса бульбочок, нітрогеназна активність і величина надземної маси за роками. Коефіцієнт кореляції між цими показниками у 2011 і 2012 роках склав 0,83-0,95. Кількість бульбочок у цей період суттєво змінювалась в залежності від сорту та штаму бульбочкових бактерій.

Таблиця 6.1

Ефективність симбіозу нових сортів сої зі штамами Bradyrhizobium japonicum на безазотному субстраті

Варіант досліду	Кількість бульбочок на рослині			Маса бульбочок, мг/рослину					Нітрогеназна активність, мМоль етилену за годину на рослину			Маса рослини, г
	2011 р.	2012 р.	середня	2011 р.		2012 р.		середня	2011 р.	2012 р.	середня	2011 р.	2012 р.	середня
Сорт Аркадія одеська
Контроль без інокуляції М-8 36 Х-9 ГС-4	0,0 10,5 3,5 3,0 1,4	3,0 13,0 16,0 10,0 18,0	1,5 11,8 9,8 6,5 9,7	0 20 10 30 10	10 83 68 102 68		5,0 51,5 39,0 66,0 39,0		0,0 3,7 0,2 0,5 0,8	0,0 0,3 0,7 0,8 1,3	0,0 2,0 0,4 0,6 1,0	2,8 4,3 4,2 4,1 3,4	4,5 5,4 5,0 5,2 5,5	3,6 4,8 4,6 4,6 4,4
Сорт Ятрань
Контроль без інокуляції М-8 36 Х-9 ГС-4	0,0 19,5 12,2 46,3 16,7	6,0 17,0 15,0 16,0 10,0	3,0 18,2 13,6 31,2 13,4	0 240 90 430 190		19 79 55 53 83		9,5 159,5 72,5 241,5 136,5	0,0 6,1 4,1 1,4 6,8	0,0 0,9 1,5 0,9 1,1	0,0 3,5 2,8 1,2 3,9	3,2 5,3 4,0 5,4 5,0	4,0 5,5 5,3 5,5 5,5	3,6 5,4 4,6 5,4 5,2
Сорт Симфонія
Контроль без інокуляції М-8 36 Х-9 ГС-4	0,0 1,8 2,2 9,0 7,8	7,0 18,0 14,0 14,0 18,0	3,5 9,9 8,1 11,5 12,9	0 5 6 150 10		79 72 65 33 102		39,5 38,5 35,5 91,5 5,6	0,0 0,1 1,0 0,4 3,2	0,0 2,4 0,5 1,1 1,4	0,0 1,2 0,8 0,8 2,3	2,8 3,5 3,6 4,0 3,3	4,1 6,0 5,0 6,0 5,0	3,4 4,8 4,3 5,0 4,2
Сорт Сяйво
Контроль без інокуляції М-8 36 Х-9 ГС-4	0,0 3,5 7,5 3,8 1,0	6,0 27,0 30,0 17,0 28,0	3,0 15,2 18,8 10,4 19,0	0 10 90 10 110		64 147 120 158 123		33,5 78,5 105,0 84,0 116,5	0,0 0,3 0,6 0,1 6,9	0,1 2,1 2,4 2,7 2,8	0,1 1,2 1,5 1,4 4,8	3,6 4,4 4,4 4,6 4,9	6,0 6,9 7,9 6,6 7,3	4,8 5,6 6,2 5,6 6,1
Сорт Фенікс
Контроль без інокуляції М-8 36 Х-9 ГС-4	0,0 12,0 13,3 20,3 4,2	14,0 22,0 20,0 17,0 24,0	7,0 17,0 16,6 18,6 14,1	0 90 110 80 10		100 98 170 127 78		50,0 94,0 140,0 103,5 44,0	0,0 4,8 1,0 1,7 0,8	0,1 2,2 0,9 2,1 1,6	0,1 3,5 1,0 1,9 1,2	3,5 4,4 4,2 4,9 4,7	4,9 6,2 6,0 5,0 6,2	4,2 5,3 5,1 5,0 5,4
НІР05	9,3	7,6		90,1		74,2			3,1	1,8		0,6	1,09

Таблиця 6.2

Порівняльна ефективність штамів Bradyrhizobium japonicum у сої

Штам	Кількість бульбочок			Маса бульбочок на рослині, мг			Нітрогеназна активність, мМоль етилену/год			Надземна маса проростків, г
	2011 р.	2012 р.	середня	2011 р.	2012 р.	середня	2011 р.	2012 р.	середня	2011 р.	2012 р.	середня
Контроль	0,0	8,2	4,1	0,0	71,8	35,9	0,0	0,0	0,0	3,2	4,8	4,0
М-8	9,4	20,5	15,0	73,0	99,0	86,0	3,0	1,9	2,4	4,4	6,0	5,2
36	7,7	18,3	13,0	61,2	110,2	85,7	1,4	1,1	1,2	4,1	5,8	5,0
Х-9	16,5	17,8	17,2	140,0	109,3	124,6	0,8	2,2	1,5	4,6	5,9	5,2
ГС-4	8,0	21,8	14,9	66,0	122,0	94,0	3,7	1,7	2,7	4,3	6,1	5,2

Таблиця 6.3

Показники симбіозу нових сортів сої за інокуляції виробничими та перспективними штамами бульбочкових бактерій

Сорт	Кількість бульбочок			Маса бульбочок на рослині, мг			Нітрогеназна активність, мМоль етилену/год			Надземна маса проростків, г
	2011 р.	2012 р.	середня	2011 р.	2012 р.	середня	2011 р.	2012 р.	середня	2011 р.	2012 р.	середня
Аркадія одеська	4,6	14,2	9,4	17,5	80,2	48,8	1,3	0,8	1,0	4,0	5,3	4,6
Ятрань	23,7	14,5	19,1	237,5	68,0	152,8	4,6	1,1	2,8	4,9	5,5	5,2
Симфонія	5,2	16,0	10,6	42,8	68,0	55,4	1,2	1,4	1,3	3,6	5,5	4,6
Сяйво	6,2	25,5	15,8	55,0	137,0	96,0	2,0	2,5	2,2	4,6	7,2	5,9
Фенікс	12,4	20,8	16,6	72,5	118,2	95,4	2,1	1,7	1,9	5,2	5,8	5,5
Берегиня	–	26,8	–	–	185,2	–	–	2,9	–	–	6,4	–

Суттєва різниця урожаю різних сортів має місце також за інокуляції насіння зернобобових культур перед сівбою набором штамів. У наших дослідженнях з трьома сортами гороху і трьома штамами бульбочкових бактерій Rhizobium leguminosarum найкращий урожай спостерігали у сорту Сіріус за інокуляції штамом К-29 і у сорту Світ за інокуляції штамом У-1 (табл. 6.4)

Таблиця 6.4

Вплив штамів бульбочкових бактерій на урожай насіння гороху (ц/га)

Штам	Світ				Одорус				Сіріус
	2012	2013	2014	сер.	2012	2013	2014	сер.	2012	2013	2014	сер.
261б, стандарт	23,1	18,2	12,5	17,9	22,6	19,1	16,4	19,4	24,7	18,6	18,0	20,4
К-29	25,8	19,6	17,9	21,1	23,3	20,5	19,9	20,8	27,5	20,2	19,5	22,4
У-1	26,4	19,6	20,7	22,2	25,1	22,5	16,5	21,4	25,8	20,8	15,3	20,6
НСР05	1,6	1,4	1,0		1,5	1,4	0,9		1,6	1,5	1,1

Подібне варіювання урожаю виявили і при випробуванні двох сортів нуту і 5 штамів бульбочкових бактерій (табл. 6.5).

Таблиця 6.5

Урожай насіння нуту в залежності від сорту та штаму бульбочкових бактерій (ц/га)

Штам	Пам’ять				Буджак
	2012	2013	2014	сер.	2012	2013	2014	сер.
Без інокуляції	10,2	16,9	9,5	12,2	9,6	15,0	10,1	11,6
Н-12, виробничий	12,9	21,6	10,2	14,9	12,5	18,1	12,8	14,5
065	12,0	21,4	11,9	15,1	7,5	15,8	10,2	11,2
068	12,9	17,2	12,9	14,3	13,7	15,4	14,0	14,4
НС-6	13,3	17,4	14,0	14,9	12,5	15,2	12,0	13,2
А-44	15,0	21,0	13,5	16,5	13,7	18,0	12,4	14,7
НСР05	1,4	1,9	1,0		2,0	1,7	1,2

Таким чином, за максимальної реалізації азотфіксувальної здатності зернобобових культур потрібно в процесі створення сортів добирати до них комплементарні штами бульбочкових бактерій. Краще це робити в польових умовах за наявності природних ризобій в ґрунті, оскільки такі дослідження дозволять одночасно оцінити і конкурентну здатність штаму, що вивчається. При цьому досить важливо, щоб ґрунт був добре збалансований за кількістю фосфору та мікроелементів.

В Амурській області, де зосереджені основні посіви сої Росії, максимальний урожай мали ті сорти, у яких формувались найбільша кількість та маса бульбочок. Необхідно відзначити, що у цій зоні в ґрунті знаходяться численні місцеві популяції бульбочкових бактерій, які відселектувались протягом досить тривалого періоду.

7. СТВОРЕННЯ СОРТІВ ЗЕРНОБОБОВИХ КУЛЬТУР З ПОКРАЩЕНИМИ АЗОТФІКСУВАЛЬНИМИ ПОКАЗНИКАМИ

Процеси формування бульбочок і азотфіксації знаходяться під чітким генетичним контролем, тому їх можливо поліпшувати відомими селекційними методами. Складність полягає лише в тому, що симбіотичні асоціації включають взаємодію двох генотипів – рослини-господаря та бульбочкової бактерії. Це накладає додаткові обмеження, поскільки існує велика амплітуда мінливості показників симбіозу в залежності від добраних штамів мікросимбіонта й генотипів рослин. Незважаючи на це, існують такі штами, які індукують посилене бульбочкоутворення та високу азотфіксувальну здатність у більшості сортів певної зернобобової культури. Наприклад, у наших дослідженнях зі значним набором сортів сої на протязі ряду років виділявся штам Bradyrhizobium japonicum М-8. Необхідно відзначити суттєвий вплив на рівень азотфіксації та показники бульбочкоутворення погодних умов року дослідження. Найбільш чутливою до посушливих умов є нітрогеназна активність, хоча спостерігається також суттєве зниження кількості та маси бульбочок.

Покращення азотфіксувального потенціалу селекційним шляхом можливо здійснювати двома способами. Перший із них полягає в комбінуванні у нових сортів зернобобових культур високої врожайності та покращених показників бульбочкоутворення та азотфіксувальної здатності шляхом гібридизації. Для реалізації такої схеми необхідний ретельний добір батьківських пар. Один компонент схрещування повинен виділятись високими показниками насіннєвої продуктивності, другий – азотфіксувальної здатності. Цей процес можна зобразити наступною схемою.

Перший рік	Р1 х Р2	Польові умови
	F1
Другий рік	F2	Польові умови
Другий рік	F3	Сівба в фітотроні, кліматичній камері або теплиці. Ріст рослин на безазотному середовищі. Добір кращих особин за надземною масою, кількістю та масою бульбочок.
Третій рік	F4	Польові умови. Висівання потомства добраних рослин окремими сім’ями. Оцінка показників бульбочкоутворення та азотфіксації. Добір кращих сімей.
Четвертий рік	F5	Сівба в фітотроні, кліматичній камері або теплиці на безазотному середовищі. Оцінка сімей за параметрами бульбочкоутворення і азотфіксації. Повторний добір кращих рослин за рівнем надземної маси.
Четвертий рік	F6	Сівба в польових умовах. Оцінка і розмноження добраних ліній за урожайністю насіння, показниками бульбочкоутворення та азотфіксації.

Запропонована схема включає схрещування високопродуктивного генотипу з метою одержання рекомбінантів, які будуть поєднувати цю ознаку із інтенсивним зв’язуванням азоту із повітря. Таке комбінування дозволить покращити азотний обмін в результаті кращого надходження цього елементу за рахунок симбіозу. Поскільки у рослині обмін речовин тісно пов’язаний, то значна частина азотовмісних сполук з бульбочок буде переходити спочатку в листки, а потім у більш пізні фази онтогенезу в насіння. У цей період функціонуючі бульбочки будуть більш інтенсивно забезпечуватись продуктами фотосинтезу. Таке взаємовигідне партнерство призведе до більш інтенсивного розвитку окремих рослин при вирощуванні їх як на безазотному середовищі, так і в польових умовах. Крім того, оцінка попередньо добраних сімей у вегетаційних дослідах при вирощуванні їх у польових умовах дасть можливість оцінити також конкурентну здатність випробовуваного штаму. Проведені нами дослідження показали, що гібридні комбінації, які випробовувались за такою схемою, дуже різнились за кількістю одержаних ліній, які поєднували покращені продуктивність і показники бульбочкоутворення та азотфіксації.

У результаті тривалої селекційної роботи з урахуванням біологічної азотфіксації нами створені сорти сої Хаджибей, Одеська 150, Альтаїр, Донька, які виділяються підвищеним рівнем зв’язування азоту із повітря.

Другий напрям селекційної роботи по покращенню азотфіксувального потенціалу зернобобових культур шляхом селекції пов’язаний з одержанням шляхом гібридизації ліній з дуже високим рівнем симбіозу. У даному випадку батьківські пари добирають таким чином, щоб комбінувати в одному генотипі окремі позитивні показники, які притаманні кожному компоненту схрещування. Наприклад, відомо, що піки азотфіксувальної здатності та показники бульбочкоутворення на протязі вегетаційного періоду у багатьох сортів сої не співпадають. Як правило, часто це пов’язано з тривалістю вегетації, але бувають випадки, коли генотипи подібної стиглості характеризуються неоднаковими профілями азотфіксувальної активності на протязі онтогенезу. У деяких із них ефективність симбіозу більша на початкових фазах розвитку, в інших – на протязі репродуктивного періоду. Тому поєднання цих онтогенетичних максимумів шляхом схрещування сортозразків, яким притаманні ці особливості, дасть можливість створити такі форми, у яких будуть поєднані вище названі онтогенетичні профілі азотфіксувальної здатності. Крім різної тривалості вегетаційного періоду, на рівень симбіозу певного сорту в процесі онтогенезу можуть впливати такі фактори як особливості росту кореневої системи, на якій формуються бульбочки, інтенсивність росту бульбочок, яка залежить від швидкості їх постачання продуктами фотосинтезу із листків, реакції макро- та мікросимбіонтів на наявність вологи та кількість мінерального азоту в ґрунті.

Спільні тривалі дослідження Всеросійського науково-дослідного інституту сільськогосподарської мікробіології та Всеросійського науково-дослідного інституту зернобобових і круп’яних культур з селекції гороху на підвищений рівень зв’язування азоту із повітря привели до створення нового сорту Тріумф. Він був виведений шляхом схрещування високопродуктивного, добре адаптованого до місцевих умов сорту Класик (рекурентна батьківська форма) з сортозразком К-8274, який виділявся підвищеним азотфіксувальним потенціалом (донорська форма). Із гібридної популяції провели індивідуальні добори більш продуктивних рослин, які також характеризувались підвищеними показниками азотфіксації. Цю програму очолює директор Всеросійського науково-дослідного інституту сільськогосподарської мікробіології, академік Російської академії сільськогосподарських наук і Національної академії аграрних наук України Тихонович І.А. Він вважає, що в майбутньому в селекції такого напряму важлива роль буде належати генетичним маркерам, які дозволять більш ефективно ідентифікувати гени, які задіяні в процесі азотфіксації та комбінувати їх в одному генотипі шляхом гібридизації.

Як ми уже згадували,існувала інша спеціальна селекційна програма, яка проводилась під егідою Міжнародного агентства з атомної енергії з метою створення ліній квасолі з підвищеним азотфіксувальним потенціалом. Дослідження проводили в 1985-1991 рр. в Австрії, Бразилії, Чилі, Колумбії, Гватемалі, Мексиці та Перу.

У селекційних програмах бажано мати декілька як рекурентних, так і донорських батьківських форм.

Реальний рівень зв’язування азоту із повітря значно менший, ніж азотфіксувальний потенціал певного генотипу мікросимбіонта, що пов’язано із впливом несприятливих умов довкілля.

Наші дослідження свідчать про те, що за умов посухи нітрогеназна активність більшості сортів сої знижується більше ніж у 30 разів. Наприклад, у посушливі роки цей показник варіював у межах 1,6-11,2 мг азоту/рослину/год, тоді як за оптимального водозабезпечення у цих же самих генотипів він сягав 31,7-103,1 мг азоту/рослину/год. При цьому за водного стресу спостерігали значно більшу мінливість нітрогеназної активності. Приблизно така ж закономірність мала місце і за масою бульбочок, сформованих на одній рослині. Кількість бульбочок за умов посухи зменшувалась повільніше порівняно з середньою їх масою на рослині та нітрогеназною активністю. Підвищеним азотфіксувальним потенціалом за недостачі вологи в ґрунті виділились сорти сої Білосніжка, Провар, Харосой,  Салют 216, Пагода, Хокей, Юг 40, Кріпиш, Деметра. Установлено, що стійкість бульбочок до зневоднення пов’язана з їх водоутримною здатністю, стійкістю ферментних систем, які пов’язані з процесом азотфіксації. Відомо, що в активних бульбочках в значній кількості нагромаджується кисень, який повинен бути інактивований системою ферментів. За посухи дія ферментних систем порушується і збільшення кількості активного кисню приводить до суттєвого інгібування процесів, які проходять в бульбочках. При цьому руйнуються клітини стінок бульбочок, порушуються плазмодесмові зв’язки в бактероїдовмісній зоні та цитоплазматична структура вакуолізованих клітин  кортексу. Такі процеси призводять до зменшення кількості інфекційних ниток, зливання симбіосом, збільшення об’єму перибактероїдного простору, лізису бактероїдів. Дослідження показали, що мінімальна вологість ґрунту, за якої бульбочки можуть розвиватись, становить біля 16% його повної вологоємності, а оптимальна лежить в межах 70-80%.

В розроблених методичних рекомендаціях запропонована методика створення сортів зернобобових культур, які поєднують підвищені продуктивність та азотфіксувальну здатність. Даний прийом протягом тривалого часу відпрацьований в процесі селекції сої в нашому інституті. Приблизно такі ж результати одержані в спільній роботі Всеросійського науково-дослідного інституту сільськогосподарської мікробіології та Всеросійського науково-дослідного інституту зернобобових і круп’яних культур при створенні сортів гороху з підвищеним рівнем зв’язування азоту із повітря.

СПИСОК ЛІТЕРАТУРИ

1. Биологическая фиксация азота: бобово-ризобиальный симбиоз / Коць С.Я., Моргун В,В., Патыка В.Ф. и др. – Киев, Логос. – 2010. – Т.1. – 508 с.
2. Князєв О.В. Підвищення азотфіксуючого потенціалу сої координованою селекцією макро- і мікросимбіонтів // Автореф. кандидата с.-г. наук. – Київ. – 1995. – 20 с.
3. Коць С.Я. Фізіологічні особливості формування та функціонування симбіотичних систем бобові рослини-бульбочкові бактерії // Матеріали Міжнародної наукової конференції «Онтогенез рослин, біологічна фіксація молекулярного азоту та азотний метаболізм». – Тернопіль. – 2001. – С.86-90.
4. Коць С.Я., Береговенко С.К., Кириченко Е.В., Мельникова Н.Н. Особенности взаимодействия растений и азотфиксирующих микроорганизмов. – Киев, Наукова думка. – 2007. – 315 с.
5. Методологія і практика використання мікробних препаратів у технологіях вирощування сільськогосподарських культур / Волкогон В.В., Заришняк А.С. і др. – Київ, Аграрна наука. – 2011. – 156 с.
6. Марьюшкин В.Ф., Даценко В.К., Курочкина А.Л., Старченков Е.П., Михайлов В.Г. Изменчивость симбиотической азотфиксации у различных генотипов сои // Физиология и биохимия культурных растений. – Т.22, №2. – 1990. – С.132-136.
7. Михайлов В.Г., Дубовенко Е.К., Чечельницкая Л.Н. Эффективность отбора на повышение азотфиксирующей способности у сои // Селекция и семеноводство. Республиканский межвед. темат. сб. – Вып. 65. – 1988. – С. 63-68.
8. Січкар В.І. Генетичні особливості селекції сої за покращеними показниками біологічної азотфіксації // Матеріали  Міжнародної наукової конференції «Онтогенез рослин, біологічна фіксація молекулярного азоту та азотний метаболізм». – Тернопіль. – 2001. – С. 134-137.
9. Сичкарь В.И., Князев А.В., Патыка В.Ф. Селекция сои на повышение симбиотической азотфиксации // Повышение симбиотической азотфиксации сои. – Научно-технический бюллетень СО ВАСХНИЛ. – Новосибирск. – Т. 33. – 1987. – С. 16-22.
10. Сичкарь В.И., Луговой А.П., Князев А.В., Патыка В.Ф., Толкачев Н.З. Влияние погодных условий на формирование клубеньков у сои и их нитрогеназную активность // Физиология и биохимия культурных растений. – 1989. – Т. 21, №2. – С. 135-140.
11. Сичкарь В.И., Патыка В.Ф., Толкачев Н.З.,  Князев А.В. Влияние штаммов клубеньковых бактерий на урожай семян, азотфиксацию и клубенькообразование у новых сортов сои в условиях юга Украины // Труды Всесоюзного научно-исследовательского института сельскохозяйственной микробиологии. – Т. 60. – 1990. – С. 32-37.
12. Січкар В.І., Кваснюк А.К., Толкачов М.З., Патика В.П. Азотфіксуюча здатність нових сортів сої // Науково-технічний бюлетень СГІ. – 1(87). – 1997. – С. 57-63.
13. Толкачев Н.З., Князев А.В., Патыка В.Ф., Сичкарь В.И. Определение азотфиксирующего потенциала бобово-ризобиального симбиоза у сои на безазотном субстрате // Збірник матеріалів ІІ Міжнародної конференції (Одеса) «Використання сучасних молекулярно-генетичних і біотехнологічних розробок у генетико-селекційних дослідженнях. – Київ, Аграрна наука. – 1998. – С. 66-68.
14. Толкачев Н.З., Сичкарь В.И. Координированная селекция сои и Bradyrhizobium japonicum на высокоэффективный симбиоз // Збірник наукових праць Уманського державного аграрного університету «Біологічні науки і проблеми рослинництва». – Умань. – 2003. – С. 270-276.
15. Current developments in soybean-Rhizobium symbiotic nitrogen fixation. Ed. Dou Xintian. – Publishing House. – Harbin. – 1993. – 493 p.
16. Herridge D.F., Danso S.K.A. Enhancing crop legume N₂ fixation through selection and breeding // Plant and Soil. – 1995. – V. 174, №1. – Р. 51-82.
17. Neuhausen S.L., Graham P.H., Orf J.H. Genetic variation for dinitrogen fixation in soybean of maturity group 00 and 0 // Crop Sci. – 1988. – V. 28, №5. – Р. 769-772.Автор:       Січкар В.І.,   доктор   біологічних  наук,  професорРецензент: Коць С.Я. , заступник директора з наукової роботи,  зав. відділу  симбіотичної азотфіксації Інституту фізіології рослин і генетики  НАН України.